Mortalitetstrender och dödsorsaker vid incident typ 2-diabetes

Omdirigera humana T-celler mot hepatit B- och C-virus via RNA

Margaret Sällberg Chen | Jun 2017 | |

Margaret Sällberg Chen
docent,
Karolinska institutet

Jacob Ahlin
läkarstuderande,
Karolinska institutet

Sjukdomar orsakade av hepatit B-virus (HBV) och hepatit C-virus (HCV) är allvarliga, och virusspecifika T-celler har en viktig roll i leversjukdomen. Virusspecifika T-celler medverkar troligen både vid leverskada och vid utläkning av hepatit B och hepatit C.1

Cytotoxiska T-celler (CTL) är primära effektorceller som medierar viruskontroll. Detta sker dels genom utsöndring av antivirala cytokiner, dels via cytolytisk aktivitet där cytokiner kan hämma virus utan att döda cellen. Studier har visat att HBV- och HCV-specifika T-celler är relativt få eller obefintliga hos personer med kronisk infektion. De har vidare visat att funktionen hos virusspecifika T-celler är bristande, och att orsaken till att de är dysfunktionella eller toleranta är dels en ständig närvaro av antigenexponering, dels hämmande effekter av virusreplikation.2–6

Omdirigering av T-celler
Användning av CAR(chimeric antigen receptor)- och TCR(T-cellsreceptor)-modifierade autologa T-celler har på senare tid genererat stor uppmärksamhet inom cancerterapi.7,8 Principen är att förstärka eller omdirigera patientens egna T-celler genom att ge T-cellerna den antigenspecificitet som krävs för att känna igen och eliminera cancerceller. Genom att helt enkelt sätta till en gen som kodar för en CAR eller TCR som är riktad mot tumören och T-cellen får den en ny specificitet. Själva den immunologiska mekanismen för en omdirigerad eliminering av målceller är gemensam även för virusspecifika T-celler. T-celler som kan söka upp och eliminera HBV- eller HCV-associerade premaligna tumörceller skulle därför kunna fungera genom samma mekanism.

Överföring av antivirala funktioner med skräddarsydda TCR
Flera studier har visat att CAR- och TCR-modifierade T-celler kan känna igen virusinfekterade celler in vitro och in vivo.9-13 Genom att använda skräddarsydda mRNA (budbärar-RNA) och transfektion har vi nyligen visat att friska T-celler snabbt kan förses med nya antivirala egenskaper i laboratoriet utan användning av traditionella virusvektorer eller kromosomal integrering.14 

Vi har visat att det kan räcka med den genetiska koden i form av ett mRNA som translaterats till anti-HBV- eller HCV-T-cellsreceptorer för att omdirigera T-celler mot HBV och HCV. Perifera blodlymfocyter (PBL) från friska donatorer såväl som från kroniskt infekterade patienter kan, efter transfektion med mRNA för anti-HCV-TCR eller anti-HBV-TCR, känna igen och hämma eller till och med döda virusinfekterade celler.

Med denna teknik kan vi föra över förmågan att eliminera virusinfekterade celler från ursprungliga virusspecifika CTL till fler nya och friska T-celler. Effektiviteten i denna funktionsöverföring är upp till 95 procent hos T-celler, framför allt till celler med CD8+ fenotyp men även till CD4+ T-celler.14 Tekniken ges oss möjlighet att redan på laboratoriet kunna välja och ge peptidantigenspecificitet (peptid) och -funktionalitet (lytisk, icke-lytisk, polyfunktionell, monofunktionell) till nya friska T-celler för att sedan i cell- och djurmodeller simulera det som en fungerande T-cellsrespons i en tolerogen miljö (som i levern bland hepatocyterna) kännetecknas av och bör bestå av vid en effektiv och skonsam eliminering av virusinfekterade celler.

Cytotoxiska T-cellers handlingssignatur kan fångas med transkriptomiska analyser
En central fråga som besvarades i vår studie var hur en framgångsrik T-cell som snabbt och effektivt kan eliminera sina måltavlor klarar sitt jobb. Denna fråga har tidigare varit svår att studera, då T-celler har många unika TCR och därför representerar en enorm mångfald och då funktionella studier på ”single-cell”-nivå är praktiskt taget omöjliga att genomföra. Den nya TCR-modifierande teknologin går ut på att föra över en enda TCR och dess specificitet till miljontals nya T-celler, och den har därför varit användbar för att besvara denna fråga.

I vår studie14 har vi använt så kallade transcriptomics, det vill säga sekvensbestämning av allt mRNA i TCR-modifierade T-celler för att ta reda på olika profiler av mRNA-uttryck hos TCR-modifierade T-celler. Vi har detaljstuderat deras funktion mot hepatocyter i en modell med leverceller som bär på replikerande HCV.15 Resultatet visar att unika mRNA-signaturer kan ses mycket snabbt (redan inom fem timmar) hos T-cellerna efter att de har kommit i kontakt med de replikerande målcellerna. Resultatet visar också att antalet unika proteinkodande gener som uttrycks är förvånansvärt få hos den TCR (NS3-1073) som är känd för att mycket effektiv döda (lysera) målcellerna. En snabb och effektiv eliminering av målcellerna är också förknippad med en fokuserad mRNA-signatur.

Vidare bioinformatoriska analyser av detekterade mRNA-signaturer kännetecknas av cytokin–cytokinreceptor-interaktioner, till exempel Jak-Stat-signalering och kemokinsignalering, steroidhormonbiosyntes, ribosomal signalering, TNF-a-inducerade apoptotiska signalvägar och metabola processer. Dessa mRNA-signaturer trappas dock ned samtidigt som målcellerna effektivt elimineras inom de första dygnen. Det är annorlunda med en annan TCR (NS5-1992), som har antivirala cytokinfunktioner men som undviker att lysera målcellerna. Intressant nog involverar denna TCR betydligt många fler differentiellt uttryckta gener, men visar inga tydliga funktionella signalvägar de första timmarna.

Med mRNA-signaturanalys kunde vi också se att antivirala icke-lytiska T cellerna delar sig under det första dygnet för att sedan välja signalvägar förknippade med autoimmun reaktivitet, celladhesion, tight-junctions, och metabola cellulära processer samtidigt som målcellerna har fått överleva. Detta är ett första arbete som har visat en detaljerad inblick i signatur och kinetik hos HCV-specifik T-cells-mRNA, och det har klinisk relevans för studier kring riktade immunterapeutiska åtgärder för att angripa virusinfekterade leverceller.

Slutsats

Hepatit B och C är vanliga orsaker till levercirros och levercancer. Drygt en miljon människor i världen dör varje år till följd av dessa sjukdomar.16 Antivirala läkemedel inklusive nya direktverkande antivirala läkemedel (DAA) har revolutionerat vården av virushepatit och kan numera bota HCV-infektion och hämma HBV-replikation. Dock kvarstår problem i dagens terapi. Risken för levercancer kvarstår fortfarande hos patienter med HCV och HBV som behandlats effektivt.17,18 

Denna grupp av patienter med levercancer väntas vara nästa stora utmaning. Faktorer som definierar ett lyckat immunsvar mot HBV- och HCV-infektion kvarstår att undersöka. Med genöverföringsteknik kan vi nu använda skräddarsydda anti-HBV-TCR och anti-HCV-TCR och föra över önskade virusspecifika funktioner till nya friska T-celler. Skräddarsydda T-celler är ett viktigt redskap som genererar kunskap om hur man bygger upp ett önskat T-cellssvar. Detta skulle så småningom kunna fungera som immunterapi för patienter med svårbehandlad HBV eller HCV, förutsatt att virusepitoperna fortfarande är oförändrade och finns kvar hos patienterna.

Referenser

Referenser

1. Rehermann B. Pathogenesis of chronic viral hepatitis: differential roles of T cells and NK cells. Nature Medicine 2013;19:859-868. 2. Sandhu P, Haque M, Humphries-Bickley T, Ravi S, Song J. Hepatitis B Virus Immunopathology, Model Systems, and Current Therapies. Front Immunol 2017;8:436. 3. Knolle PA, Thimme R. Hepatic immune regulation and its involvement in viral hepatitis infection. Gastroenterology 2014;146:1193-1207. 4. Chen M, Sallberg M, Thung SN, Hughes J, Jones J, Milich DR. Nondeletional T-cell receptor transgenic mice: model for the CD4(+) T-cell repertoire in chronic hepatitis B virus infection. Journal of Virology 2000;74:7587-7599. 5. Chen M, Sallberg M, Thung SN, Hughes J, Jones J, Milich DR. Modeling the T-helper cell response in acute and chronic hepatitis B virus infection using T-cell receptor transgenic mice. Antiviral Res 2001;52:99-111. 6. Chen MT, Billaud JN, Sallberg M, Guidotti LG, Chisari FV, Jones J, Hughes J, et al. A function of the hepatitis B virus precore protein is to regulate the immune response to the core antigen. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101:14913-14918. 7. Hinrichs CS. Molecular Pathways: Breaking the Epithelial Cancer Barrier for Chimeric Antigen Receptor and T-cell Receptor Gene Therapy. Clin Cancer Res 2016;22:1559-1564. 8. Gros A, Parkhurst MR, Tran E, Pasetto A, Robbins PF, Ilyas S, Prickett TD, et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nat Med 2016;22:433-438. 9. Krebs K, Bottinger N, Huang LR, Chmielewski M, Arzberger S, Gasteiger G, Jager C, et al. T cells expressing a chimeric antigen receptor that binds hepatitis B virus envelope proteins control virus replication in mice. Gastroenterology 2013;145:456-465. 10. Koh S, Shimasaki N, Suwanarusk R, Ho ZZ, Chia A, Banu N, Howland SW, et al. A practical approach to immunotherapy of hepatocellular carcinoma using T cells redirected against hepatitis B virus. Molecular therapy. Nucleic acids 2013;2:e114.