Myelinestimering med kvantitativ MR korrelerat med Luxol Fast Blue-infärgade hjärnprov

Marcel Warntjes | Sept 2017 | Multipel skleros |

Marcel Warntjes
förste forskningsingenjör,
Centrum för medicinsk
bildvetenskap och visualisering,
Linköpings universitet, och CTO,
Synthetic MR AB, Linköping

Marcus Swanson
software developer,
Synthetic MR AB,
Linköping

Att kunna mäta mängden myelin i hjärnan är viktigt vid neurodegenerativa sjukdomar som multipel skleros eller demens, där man under sjukdomens förlopp kan observera en nedbrytning av myelin.1

Det finns även en klinisk nytta med att kunna göra dessa mätningar för att följa hjärnans utveckling. Med MR finns det ett antal indirekta sätt att mäta myelin, och de flesta är baserade på multikomponentanalys av T2-relaxationen, då observationen av en kort T2-relaxationskomponent tillskrivs närvaron av tunna lager av vatten inuti myelinskidan.2

En nyligen publicerad artikel har dragit slutsatsen att närvaron av partiell myelinvolym kan påvisas genom dess effekt på intra- och extracellulärt vatten till följd av magnetiseringsutbyte.3 Närheten av myelin minskar den lokala longitudinella relaxationshastigheten (R1), den transversella relaxationshastigheten (R2) och protondensiteten (PD).

Med hjälp av en snabb, kvantitativ MR-avbildning (qMRI) av relaxationshastigheterna och protondensiteten mäts ett multiparametriskt utrymme, vilket ger en grund för estimering av den partiella myelinvolymen i varje voxel. Då qMRI-sekvensen endast tar 5–7 minuter skulle den kunna vara lämplig för rutinmässig klinisk användning. Denna metod för myelinestimering validerades i en studie publicerad i American Journal of Neuroradiology.4

Syfte
Syftet med studien var att validera modellen ytterligare genom att korrelera den uppskattade mängden myelin från kvantitativ MR med den uppskattade mängden myelin från fotografier av hjärnskivor färgade av Luxol Fast Blue (LFB) vid obduktion. LFB anses som histologisk gold standard för att påvisa myelin.

Metod
Till studien användes 12 intakta lik av nyligen avlidna personer, varav 9 män och 3 kvinnor, med en medelålder på 62 ± 10 år. Lik som hade påverkats av trauma eller som hade en känd sjukdomshistorik med hjärnsjukdom uteslöts från studien. Tiden från att döden inträffat till dess obduktionen genomfördes var mellan 20 timmar och 3 dagar.

En översikt av hela processen kan ses i figur 1. Liken undersöktes med qMRI för att mäta relaxationstiderna T1, T2 och protondensiteten. Den longitudinella relaxationshastigheten R1 motsvarar 1/T1 och den transversella relaxationshastigheten R2 motsvarar 1/T2. Den qMRI-sekvens som användes var en ”multi-echo saturation recovery turbo-spin-echo”-sekvens med 7 minuters skanningstid. MR-kameran som användes var en 3T Ingenia (Philips Healthcare, Best, Nederländerna) medan efterbearbetningen utfördes med SyMRI 8.0 (SyntheticMR, Linköping, Sverige).

R1-, R2- och PD-kartorna användes som indata till myelinmodellen enligt den tidigare studien.3 Kort förklarat består modellen av fyra partiella volymer per voxel: partiell myelinvolym (VMY), partiell cellulär volym (VCL), partiell volym av fritt vatten (VFW) samt partiell volym av överskott av parenkymalt vatten (VEPW), där varje partiell volym har olika egenskaper av R1, R2 och PD. Egenskaperna hos VFW och VEPW bestämdes till samma som för CSF (R1 = 0,24 sekunder-1, R2 = 0,87 sekunder-1 och PD = 100 procent). R2 för VMY bestämdes till 77 sekunder-1, baserat på tidigare litteratur. Resterande parametrar av modellen bestämdes genom att observera R1, R2 och PD för varje voxel i hjärnorna hos en grupp friska försökspersoner.

Likens hjärnor avlägsnades under obduktion och skars i 2 cm tjocka koronala skivor för att sedan blötläggas i formalin under fem dagar. Endast den vänstra hemisfären inkluderades i studien. Efter behandlingen med formalin delades skivorna i sex mindre bitar för att passa i de 4 × 6 cm stora glasskivorna och skivades till 4 µm tjocklek. Skivorna infärgades med Luxol Fast Blue och fotograferades sedan i en fixerad installation med ljusbord och stativ. Zoom och fokus var manuellt inställda och hölls konstanta. Fotografierna delades upp i tre kanaler, rött (R), grönt (G) och blått (B), med värden på 0–255. Till detta användes ett specialbyggt IDL-program (ITT Visual Information Solutions, Boulder, Colorado). Optisk densitet (OD) definierades som summan av RGB-kanalerna för varje pixel. Detta värde normaliserades sedan genom att divideras med 3 × 255 och fick då ett intervall mellan 0 (ingen färg) och 1 (fullt färgad). Den histologiska utvärderingen av hjärnskivorna genomfördes av en certifierad rättsmedicinsk patolog, som inte hade tillgång till resultatet av MR-bilderna.

Från R1-, R2- och PD-kartorna skapades en syntetisk PD-viktad bild för att få fram en hög kontrast mellan vit vävnad (WM) och grå vävnad (GM). De histologiska fotografierna blev manuellt inpassade till den PD-viktade bilden genom rotering, transformering och skalning.

Resultat
I figur 2 visas den uppskattade mängden myelin från histologiska fotografier (vänster kolumn) och qMRI (mittkolumnen) för alla 12 liken. En visuell granskning av bilderna visar en god överrensstämmelse mellan de båda metoderna, dock ger de histologiska fotografierna i vissa fall ett ojämnt resultat. Exempelvis syns i figur 2B två histologiska prov som är placerade tätt intill varandra och som uppvisar skillnader i intensitet. I figur 2D, -K och -L syns även en gradient i de yttre delarna. Spearmans rangkorrelation visar en korrelation för alla parametrar; R1 (0,63 ± 0,12), R2 (0,11 ± 0,28), PD ( -0,73 ± 0,09) och myelin (0,74 ± 0,11). Den histologiska undersökningen av de 12 hjärnorna visade att alla hade tecken på lindrigt cerebralt ödem.

Diskussion

I den aktuella studien gjordes en jämförelse mellan hjärnor infärgade med myelinkänsligt Luxol Fast Blue och en qMRI-metod för uppskattning av myelin. En utmaning vid MR-undersökningar av lik är att begränsa de förändringar som sker i hjärnan efter döden på grund av bland annat dödsorsak, längd på dödsförlopp, temperatur, minskat blodflöde, förruttnelseprocesser och så vidare. I studien användes nyligen avlidna som snabbt kyldes ner för att minimera förruttnelseprocessen. Hjärnorna var intakta och påverkades inte negativt av obduktionen eller konserveringen. Dock visade alla hjärnor tecken på lindrigt cerebralt ödem, trots att det vid den efterföljande undersökningen inte gjordes några anmärkningsvärda observationer. Orsaken till det lindriga cerebrala ödemet kan ha varit syrebrist under dödsförloppet, trots att de avlidna hade dödsorsaker som inte främst påverkar hjärnan. Dödsförloppet kan ha pågått under flera minuter, vilket skulle kunna ha varit tillräckligt för att orsaka syrebrist i hjärnan på grund av avstannad cirkulation och blodsyresättning.5

Likets temperatur spelar en viktig roll för insamlade data. Medeltemperaturen hos de 12 liken var 7,8°C, vilket minskar relaxationstiderna T1 och T2. Den största minskningen uppmättes hos CSF, men det förekom även i mindre omfattning i hjärnans vävnad. För att få rimliga data till myelinmodellen gjordes en temperaturkorrigering för T1. Enligt en tidigare rapport skulle förändringarna i T1 som en funktion av temperatur ha ett linjärt beteende i hjärnvävnad, vilket uppmättes även i denna studie. Den observerade lutningen på den linjära kurvan var däremot bara hälften så stor som de rapporterade värdena från Birkl med flera (1,5 mot 3 ms/°C för WM och 9 mot 17 ms/°C för GM).6 Med korrigeringarna för temperatur blev indata till myelinmodellen liknande den för levande personer.

Infärgning med Luxol Fast Blue är inte en kvantitativ mätmetod, då de slutgiltiga OD-värdena beror på detaljer i infärgningen. Aktsamhet vidtogs för att hålla förutsättningarna så lika som möjligt, men färgskillnader kan uppstå på grund av små skillnader i färgämnets koncentration, tidsskillnader eller avvikelser i skivornas tjocklek. OD-värdena från GM och WM i de undersökta hjärnorna hade en naturlig variation inom ett rimligt intervall, men som kan observeras i figur 2 uppnås inte alltid ett jämnt resultat med infärgningsmetoden.

Inpassningen av de histologiska fotografierna till de syntetiska PD-viktade bilderna är ett utmanande moment. Överlag så är positionen av skivorna inte helt överensstämmande med MR-bilderna, och fixeringen av skivorna leder till krympning, sprickor och olika deformationer.7 Utöver detta är det en ansenlig skillnad i upplösning hos MR-bilderna och de histologiska fotografierna. I denna studie motsvarar varje pixel i MR-bilderna 0,7 × 0,7 × 4 mm medan varje pixel i fotografierna motsvarar 0,02 × 0,02 × 0,004 mm.

En korrelation observerades mellan infärgningen av myelin med LFB och myelinuppskattningen med qMRI. Den kvantitativa MR-sekvensen är inte tillräckligt snabb för att analysera den korta relaxationen av myelinvatten. Men närvaron av partiell myelinvolym antyds av dess magnetiseringsbyteseffekt på de cellulära R1- och R2-relaxationshastighetskomponenterna samt att protondensiteten minskar. Korrelationen mellan OD-värdena från de histologiska fotografierna och den qMRI-uppskattade mängden myelin har ett högre värde (???? = 0,74 ± 0,11) än de separata korrelationerna för R1, R2 och PD (???? = 0,63 ± 0,12, 0,11 ± 0,28 och 0,73 ± 0,09).

Detta ger stöd för uppfattningen att modellen kan använda information från alla tre parametrarna för att uppskatta mängden myelin. Ett förbryllande resultat är de höga värdena för R1 och PD jämfört med R2, men detta kan bero på det tidigare nämnda cerebrala ödemet. En indirekt mätning som denna kan ha begränsningar i jämförelse med ett mer direkt sätt med flera komponenter, men för klinisk användning kan det vara viktigare att mätvärdena är stabila. Den kvantitativa MR-metod som används i denna studie är exempelvis okänslig för inhomogenitet i B1-fältet och brister i radiofrekvensens pulsprofil,8 och repeterbarhetsstudier har visat ett väldigt lågt fel i uppmätt volym, till exempel 0,14 procent i hjärnstorlek.9 Den kliniska nyttan av metoden får ytterligare stöd i de inledande observationerna av Hagiwara med flera,10 där stora skillnader sågs mellan olika typer av vit vävnad och plack hos patienter med MS.

Resultaten visar att myelin indikerar ett icke-signifikant men positivt skärningspunktsvärde med infärgningsmetoden, vilket antyder att myelinmodellen kan ge värden för GM som är högre i jämförelse med infärgningsmetoden. Denna upptäckt är överraskande, eftersom de förmodade begränsningarna i båda metoderna borde leda till ett negativt skärningspunktsvärde som ger lägre värden för qMRI-uppskattat myelin i GM jämfört med infärgningsmetoden. Förklaringen kan ligga i bruset i MR-mätningarna, då det går att mäta högre myelinvärden på grund av brus medan värden under 0 inte är möjliga. Låga myelinvärden kan därför få en viss förskjutning.

 

 

Slutsats

En korrelation kunde påvisas mellan en qMRI-metod för upptäckt av myelin och infärgning av histologiska hjärnprover med Luxol Fast Blue, vilket stödjer validiteten av myelinmätning med qMRI-metoden.

Intressekonflikter

Båda Marcus Swanson och Marcel Warntjes är anställda på SyntheticMR AB.

Referenser

1. Miller DH, et al. Measurement of atrophy in multiple sclerosis: pathological basis, methodological aspects and clinical relevance. Brain 2002;125(8):1676-1695.  2. Oh J, et al. Multislice brain myelin water fractions at 3T in multiple sclerosis. Journal of Neuroimaging 2007;17(2):156-163. 3. Warntjes M, Engström M, Tisell A, Lundberg P. Modeling the Presence of Myelin and Edema in the Brain Based on Multi-Parametric Quantitative MRI. Front Neurol 2016;7:16.  4. Warntjes J, Persson A, Berge J, Zech WD. Myelin Detection Using Rapid Quantitative MR Imaging Correlated to Macroscopically Registered Luxol Fast Blue–Stained Brain Specimens. American Journal of Neuroradiology 2017;38(6):1096-1102. 5. Hausmann R, Vogel C, Seidl S, Betz P. Value of morphological parameters for grading of brain swelling. International Journal of Legal Medicine 2006;120(4):219-225. 6. Birkl C, et al. Temperature-induced changes of magnetic resonance relaxation times in the human brain: a postmortem study. Magn Reson Med 2014;71(4):1575-1580. 7.  Moore GR, et al. A pathology-MRI study of the short-T2 component in formalin-fixed multiple sclerosis brain. Neurology 2000;55(10):1506-10. 8. Levesque IR, Pike GB. Characterizing healthy and diseased white matter using quantitative magnetization transfer and multicomponent T2 relaxometry: A unified view via a four-pool model. Magnetic Resonance in Medicine 2009;62(6):1487-1496.  9. Granberg T, et al. Clinical Feasibility of Synthetic MRI in Multiple Sclerosis: A Diagnostic and Volumetric Validation Study. American Journal of Neuroradiology 2016;37(6):1023-1029.  10. Hagiwara A, et al. Utility of a Multiparametric Quantitative MRI Model That Assesses Myelin and Edema for Evaluating Plaques, Periplaque White Matter, and Normal-Appearing White Matter in Patients with Multiple Sclerosis: A Feasibility Study. American Journal of Neuroradiology 2017;38(2):237-242.