Rökning är associerat med lägre serumnivåer av sPD-L1 hos rökare

Caroline Wasén, | okt 2018 | |

Caroline Wasén,
leg. apotekare, doktorand,
Avdelningen för reumatologi
och inflammationsforskning,
Institutionen för medicin,
Göteborgs universitet

RA är en autoimmun sjukdom som angriper leder vilket kan resultera i smärta och permanenta skador på lederna. Den bakomliggande orsaken till uppkomsten av RA är inte fullständigt beskriven, men vi vet att T-celler spelar en avgörande roll i sjukdomsetiologin. 

Aktiviteten hos T-celler balanseras under normala förhållanden av co-receptorer uttryckta på cellens yta. Det finns både co-stimulatoriska receptorer, som måste aktiveras för att cellen ska vara funktionell, och co-inhibitoriska receptorer, som begränsar cellens aktivitet och är nödvändiga för att motverka autoimmuna reaktioner. Bland de co-inhibitoriska receptorerna finns PD-1 (programmed cell death protein-1) som aktiveras av liganderna PD-L 1 och PD-L 2. Att PD-1 kan spela en avgörande roll i att motverka RA har forskare nyligen lärt sig. 

Kunskapen baseras på studier av patienter med malignt melanom som behandlats med antikroppar mot PD-1, varvid RA-liknande tillstånd förekom som biverkning av behandlingen. Då vi i en tidigare studie analyserade aktiverade cytotoxiska CD8-T-celler och upptäckte en lägre andel PD-1-uttryckande celler i prover tagna från rökare fångade detta således omedelbart vårt intresse.1 

Detta är inte minst intressant för att rökning i sig är en känd riskfaktor för RA, vilket leder till frågan: Är nedreglering av PD-1 ett viktigt steg i utvecklingen av RA hos rökare? Eftersom vår första studie i det här ämnet grundades på ett relativt litet antal studiedeltagare bestämde vi oss för att i nästa studie byta metod för att kunna studera PD-1-reglering i ett större antal patienter. PD-1 har en ligand som förkommer i löslig form (förkortas på engelska sPD-L1) och som därför har den stora fördelen att den enkelt kan mätas i serumprover med hjälp av ELISA. Målet med studien var att undersöka om rökning var associerat med lägre nivåer av sPD-L1.

Rökning leder till sänkt produktion av sPD-L1
Vi mätte sPD-L1-nivån i serum från 252 patienter med RA med känd rökstatus.2 Då vi ville vara säkra på att vi utredde en oberoende association mellan rökning och sPD-L1 samlade vi även information om variabler som kunde påverka sPD-L1. Bland dessa fanns inflammatoriska markörer, autoantikroppsstatus, information om patienternas behandlingar samt demografiska variabler. 

Genom korrelationsanalys identifierade vi de variabler som hade en signifikant association med patienternas sPD-L1-nivåer. Bland dessa fanns rökning, IL-6, IL-1b, aCCP-status och den veckovisa metotrexatdos som patienterna erhöll. För att analysera vilket samband som fanns mellan rökning och sPD-L1, med hänsyn tagen till dessa co-variabler, genomfördes multipel logistisk regression. För denna analys delades patienterna in i två grupper baserat på deras sPD-L1-nivåer. Vi kunde se att rökning och sPD-L1 verkligen hade en signifikant negativ association med varandra, vilket bekräftade vår hypotes. Vidare kunde vi se en positiv association mellan sPD-L1 och både IL-1b och aCCP. 

aCCP influerar sPD-L1-nivåer
Medan kopplingen mellan sPD-L1 och IL-1b var väntad, eftersom inflammation i sig stimulerar uttrycket av sPD-L1, så var kopplingen till aCCP helt oväntad. För att lära oss mer om förhållandet mellan aCCP och sPD-L1 genomförde vi ett in vitro-experiment. Vi isolerade mononukleära celler från perifert blod (PBMC) från friska donatorer och stimulerade dem med IgG isolerat från patienter med RA som var positiva eller negativa för aCCP. 

Vi blev överraskade när vi såg att de kulturer som stimulerats med aCCP producerade lägre, snarare än högre, nivåer av aCCP. För att få klarhet i varför denna korta stimulering (72 timmar) gav en annan respons än den vi förutspått gick vi tillbaka till vårt stora patientmaterial och stratifierade patienterna baserat på sjukdomsduration i spann om tre år. Vi såg då att bara patienter som varit diagnostiserade längre än tre år hade högre sPD-L1-nivåer om de var aCCP-positiva. 

Även terapeutiska antikroppar kan påverka sPD-L1
Vi frågade oss om aCCP var unikt i sin förmåga att producera denna effekt eller om behandling av patienter med terapeutiska antikroppar kan leda till en likande effekt på sPD-L1-nivåer. Vi genomförde därför ett litet pilotförsök där vi mätte sPD-L1-nivåer hos TNF-α-hämmarnaiva patienter före och efter deras första infusion med infliximab. 

Vi såg att 24 timmar efter den första infusionen hade patienterna faktiskt lägre serumnivåer av sPD-L1. Vi återgick till det större materialet stratifierat på sjukdomsduration och kunde se att bland patienter som varit diagnostiserade med RA i upp till tre år förekom ett liknande förhållande. Återigen hade patienter behandlade med TNF-α-hämmande antikroppar lägre nivåer. Bland patienter med en sjukdomsduration på 7–9 år rådde dock det omvända förhållandet, likt situationen hos aCCP-positiva. 

Antikroppar influerar sPD-L1 genom att aktivera Fc-gammareceptorer
Då likheterna mellan responsen på aCCP och TNF-α-hämmande antikroppar var så slående resonerade vi att effekten sannolikt uppnås genom att aktivera Fc-gammareceptorer. Vi analyserade därför mRNA-uttrycket av en stimulerande och en inhiberande Fc-gammareceptor för att räkna ut kvoten mellan den inhiberande och den stimulerande receptorn. Vi analyserade först cellkulturerna som vi stimulerat med IgG-antikroppar, och såg att de kulturer som producerat högst nivå av sPD-L1 faktiskt hade en lägre inhibitorisk kvot. Än mer intressant var det att analysera receptoruttrycket hos PBMC berikat med antigenpresenterande celler från rökare och icke-rökare. Då såg vi att rökare dessutom hade en högre inhibitorisk kvot. 

Slutsats

Sammanfattningsvis visade vår studie att inflammation är associerat med högre sPD-L1-nivåer, troligtvis därför att inflammationen stimulerar antigenpresenterande celler till att uttrycka PD-L1 (figur 1). Antigenpresenterande celler uttrycker Fc-gammareceptorer av både stimulatoriska och inhibitoriska subklasser. Både autoantikroppar och terapeutiska antikroppar influerar sPD-L1-nivåer, förmodligen genom att aktivera dessa receptorer. Rökning leder till lägre nivåer av sPD-L1, förslagsvis genom att höja kvoten av inhibitoriska Fc-gammareceptorer. Eftersom sPD-L1 binder till och inhiberar T-cellsaktiviteten hos både cytotoxiska T-celler och T-hjälparceller är det troligt att detta har en negativ inverkan på sjukdomsförloppet vid RA. 

Referenser

1. Wasén C, et al. Smoking activates cytotoxic CD8+ T cells and causes survivin release in rheumatoid arthritis. Journal of Autoimmunity 2017;78:101-110. 2. Wasén C, et al. Smoking Is Associated With Low Levels of Soluble PD-L1 in Rheumatoid Arthritis. Frontiers in Immunology 2018;9:1677.